 | Человек-паук — Главный герой, обычный подросток, но после укуса генетически мутировавшего паука обрёл сверхспособности. От своего покойного дяди Бена он узнал, что большая сила требует большой ответственности. Его настоящие имя Питер Бенджамин Паркер. Влюблён в Гвен, однако понял это только в конце 2-го сезона. Но был он весь 2-ой сезон вместе с Лиз, потому что она не отставала от Питера. А Гвен не сказала Гарри Озборну, что она любит Питера. |
 | Гвен Стейси — Дочь полицейского, одноклассница и лучший друг Питера. Она тайно влюблена в него и призналась в своих чувствах в конце 1-го сезона. В этом сериале она, фактически, заменила Мэри Джейн. |
 | Гарри Озборн — Друг Питера, сын богатого бизнесмена Нормана Озборна. Он постоянно живёт в тени отца, который уделяет ему мало внимания. Гарри встречается с Гвен, хотя знает об её чувствах к Питеру. |
 | Флэш Томпсон — капитан школьной футбольной команды. Он ярый фанат Человека-Паука, хотя над Питером он часто издевается. Настоящее имя — Юджин |
 | Мэри Джейн Уотсон — Племянница подруги тёти Мэй. Она ходила с Питером на осенний бал, а позже перешла в эту же школу. В отличие от предыдущих экранизаций комиксов, в этом сериале она не является объектом любви Питера, а наоборот пыталась помочь развитию отношений между ним и Гвен. |
 | Лиз Аллен — девушка из группы поддержки, бывшая подружка Флэша. Она влюбилась в Питера и встречалась с ним в течение 2-го сезона. Питер всё же порвал с ней, когда понял, что любит Гвен. |
Тетя Мэй — Любимая тётя Питера, которая воспитала его. После смерти её мужа Бена Паркера, она стала фактически единственным родственником Питера. Они очень близки, и Питер всегда старается помочь ей.
Джей Джона Джеймсон — вспыльчивый владелец газеты Daily Bugle, где работает Питер. Постоянно критикует Человека-паука и старается выставить его злодеем.
Норман Озборн — отец Гарри и глава OsCorp. По характеру довольно жесток, никогда не извиняется. Сотрудничал с Бигмэном и другими злодеями, замешан во многих преступлениях в Нью-Йорке.
Джордж Стейси — капитан полиции, отец Гвен. Он довольно добродушен и верит, что Человек-Паук защищает город.
Чёрная кошка — Она же Фелиция Харди. Воровка, однако влюбляется в Человека-Паука и помогает ему в некоторых сериях, пока не выясняется, что её отец — вор который когда-то убил Бена Паркера
Зловещая шестёрка, команда врагов Человека-паука в мультсериале Новые приключения Человека-Паука.
Громилы — Небольшая, но хорошо известная в Нью-Йорке банда. Она специализируется на выполнении грязной работы для криминальных боссов. Как и в любой преступной группировке, у Громил есть свои «бойцы»: Монтана, Красавчик Дэн и Окс Фэнси. Человек-паук сталкивается с ними в первой серии. Впоследствии Монтана становится Шокером, Красавчик Дэн — Рикошетом (англ. Ricochet), а Фэнси — Быком (англ. Ox).
Веном — Эдди Брок, друг детства Питера. Раньше он работал в лаборатории доктора Коннорса и часто помогал Питеру и Гвен, пока не соединился с инопланетным симбиотом. Из-за Человека-Паука он потерял работу и возненавидел его, особенно когда узнал, что Человек-Паук — это Питер. После этого его целью стала лишь месть. В мультсериале в отличие от комиксов, Веном - единственный, кто знает тайну личности Человека-Паука.
Стервятник — В прошлом был инженером-электроником, который создавал оружие для «OsCorp», но когда Норман Озборн уволил его, решил отомстить и стал работать с Громилами. Создал для себя специальное приспособление, позволяющее ему летать и наделяющее особой защитой. Его настоящие имя — Эдриан Тумс.
Электро — Макс Диллон, вместе с Паркером и Броком работал в лаборатории доктора Коннорса, но в результате несчастного случая приобрёл электрическую форму, и способность повелевать электроэнергией.
Ящер — доктор Курт Коннорс, учёный-биолог, который работал над сывороткой регенерации, чтобы восстановить ампутированую руку. Эксперимент удался, но Коннорс в результате стал гигантской рептилией, из чьего облика очень быстро вернулся. После этого больше не превращался.
Песочный Человек — Флинт Марко, старый друг и напарник Носорога. Целиком сделан из цветного песка. При своём последнем появлении спас людей во время катастрофы на танкере, которую сам же и вызвал.
Носорог — старый друг Песочного Человека. Обладает громадной силой, а его костюм очень прочен.
Доктор Октопус/Мастер Плана — Отто Октавиус, бывший сотрудник компании Озкорп. Из-за несчастного случая, подстроенным Зелёным Гоблином, клешни-манипуляторы намертво припаялись к Отто и помутили его рассудок. До аварии Октавиуса изображают как трусливым и робким ученым. После инцидента его характер преображается. Является одним из боссов Зловещей Шестерки.
Хамелеон — Злодей со способностью менять лица.
Шокер — Злодей, использующий специальные устройства, вызывающие звуковые колебания.
Мистерио — Мастер спецэффектов и трюков, которые он использует для совершения пресуплений.
Крэйвен-охотник- Охотник и укротитель зверей. Человека-паука он увидел в газете и отправился в Нью-Йорк. Затем Сергей Кравинов был вызван Доктором Осьминогом, чтобы победить Человека-Паука, но когда Кравинов проиграл в битве, то обратился к генетику Майлзу Уоррену, который превратил его в Крэйвена — наполовину человека, наполовину льва. Крэйвен-охотник заменил Доктора Осьминога.
Тумбстоун — Большой босс, отец нью-йоркской мафии. Заменил в мультсериале Амбала.
Тинкерер — Финеас Мэйсон. Учёный, работающий сначала на Хамелеона, потом на Доктора Осьминога.
Расплавленный Человек — Марк Рэкстон, брат Лиз Аллен. Желая заработать, участвовал в секретном эксперименте, в результате которого получил раскалённую кожу. Превращения Рэкстона контролируются Зелёным Гоблином.
Зелёный гоблин — Норман Озборн. Вначале казалось, что это Гарри. Он погиб в последней серии. Но в конце показывают человека в аэропорту, который произносит фразу: "Не извиняйтесь, берите пример с меня", после чего становится ясно, что злодей еще жив.
